在發(fā)酵工業(yè)中，所有涉及純種培養(yǎng)的發(fā)酵罐均需嚴(yán)格滅菌，以防止雜菌污染導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)抑制、產(chǎn)物合成受阻或代謝路徑改變。以下是需嚴(yán)格滅菌的發(fā)酵罐類(lèi)型及核心滅菌方法：

一、需嚴(yán)格滅菌的發(fā)酵罐類(lèi)型

1. 好氧發(fā)酵罐  

  - 典型場(chǎng)景：抗生素（青霉素、紅霉素）、氨基酸（谷氨酸）、酶制劑（淀粉酶）發(fā)酵。  

  - 滅菌原因：好氧環(huán)境適合多數(shù)微生物生長(zhǎng)，雜菌易通過(guò)通氣系統(tǒng)、攪拌軸封等侵入，與生產(chǎn)菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和氧氣，甚至分泌降解酶破壞目標(biāo)產(chǎn)物（如雜菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶可分解青霉素）。  

2. 厭氧發(fā)酵罐  

  - 典型場(chǎng)景：有機(jī)酸（乳酸、檸檬酸）、丙酮丁醇、沼氣發(fā)酵。  

  - 滅菌原因：雖為厭氧環(huán)境，但部分雜菌（如產(chǎn)酸菌）在低氧條件下仍可繁殖，消耗底物并產(chǎn)生酸性物質(zhì)，抑制目標(biāo)菌代謝（如乳酸發(fā)酵中污染大腸桿菌會(huì)導(dǎo)致pH下降，乳酸得率降低）。  

3. 基因工程菌發(fā)酵罐  

  - 典型場(chǎng)景：重組蛋白（胰島素、干擾素）、基因工程疫苗生產(chǎn)。  

  - 滅菌關(guān)鍵：工程菌常為“營(yíng)養(yǎng)缺陷型”或攜帶外源質(zhì)粒，雜菌可能通過(guò)掠奪營(yíng)養(yǎng)（如必需氨基酸）或分泌抗生素類(lèi)物質(zhì)（如細(xì)菌素）導(dǎo)致工程菌死亡，甚至引發(fā)外源基因泄漏風(fēng)險(xiǎn)。  

4. 細(xì)胞培養(yǎng)罐（動(dòng)物/植物細(xì)胞）  

  - 典型場(chǎng)景：?jiǎn)慰寺】贵w、病毒疫苗（如新-冠疫-苗）生產(chǎn)。  

  - 滅菌特殊性：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)雜菌（尤其是支原體、真菌）極其敏感，污染后易引發(fā)細(xì)胞凋亡或代謝紊亂，且難以通過(guò)后期純化去除。  

二、核心滅菌方法

發(fā)酵罐滅菌需兼顧滅菌徹-底性與設(shè)備耐受性，避免高溫、高壓對(duì)罐體材質(zhì)（如不銹鋼）、傳感器（如pH電極）或培養(yǎng)基成分（如維生素、氨基酸）的破壞。以下是主要方法：

1. 蒸汽滅菌（SIP，Steam In Place）——最-常用方法  

原理：利用飽和蒸汽的高溫（通常121℃、0.1 MPa，或135℃、0.22 MPa）殺滅微生物（包括芽孢、孢子），通過(guò)蒸汽冷凝釋放潛熱實(shí)現(xiàn)熱傳導(dǎo)滅菌。  

適用場(chǎng)景：空罐滅菌、培養(yǎng)基連消（連續(xù)滅菌）、管路系統(tǒng)滅菌。  

操作要點(diǎn)：  

- 空罐滅菌：  

 - 關(guān)閉所有進(jìn)料閥，開(kāi)啟排氣閥，通入蒸汽使罐內(nèi)溫度升至121℃，維持30~60分鐘（根據(jù)罐體容積調(diào)整，如50 m³罐需維持60分鐘）。  

 - 關(guān)鍵：確保蒸汽穿透所有角落，避免“死角”（如攪拌軸縫隙、噴嘴背側(cè)），可通過(guò)熱電偶監(jiān)測(cè)罐體不同部位溫度差（應(yīng)＜1℃）。  

- 實(shí)罐滅菌（培養(yǎng)基滅菌）：  

 - 培養(yǎng)基直接裝入發(fā)酵罐，通入蒸汽升溫至121℃，維持20~30分鐘。  

 - 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需額外連消設(shè)備；缺點(diǎn)：高溫可能破壞熱敏感物質(zhì)（如葡萄糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)），可通過(guò)“分消”（先滅糖，后滅氮源）優(yōu)化。  

- 連消（連續(xù)滅菌）：  

 - 培養(yǎng)基通過(guò)板式換熱器或連消塔，在135℃、3~5分鐘內(nèi)快速滅菌，隨后通入已滅菌的發(fā)酵罐。  

 - 優(yōu)勢(shì)：滅菌時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)成分保留率高（如維生素?fù)p失比實(shí)罐滅菌減少50%），適合大規(guī)模生產(chǎn)。  

設(shè)備要求：  

- 罐體需耐受高溫高壓（材質(zhì)為316L不銹鋼，耐壓≥0.3 MPa）；  

- 配置蒸汽進(jìn)口、排氣口、安全閥及溫度/壓力傳感器，確保滅菌過(guò)程可監(jiān)控。

2. 化學(xué)滅菌（消毒）——輔助方法  

原理：利用化學(xué)試劑的強(qiáng)氧化性或膜損傷作用殺滅微生物，適用于無(wú)法耐受高溫的部件或環(huán)境。  

常用試劑：  

- 甲醛熏蒸：  

 - 用于空罐滅菌（尤其是玻璃罐或小型試驗(yàn)罐），將甲醛溶液（37%~40%）加熱汽化，維持罐內(nèi)甲醛濃度10~15 mg/L，密封12~24小時(shí)。  

 - 缺點(diǎn)：甲醛有毒性，需通風(fēng)換氣48小時(shí)以上才能使用，目前逐漸被替代。  

- 過(guò)氧乙酸噴霧/擦拭：  

 - 2%過(guò)氧乙酸溶液用于罐體內(nèi)部表面消毒，作用15~30分鐘后用無(wú)菌水沖洗，適用于局部滅菌（如接種口、取樣閥）。  

- 臭氧滅菌：  

 - 通過(guò)臭氧發(fā)生器產(chǎn)生O?氣體，通入罐內(nèi)維持濃度≥60 mg/m³，作用30分鐘以上，適用于潔凈區(qū)環(huán)境或管路系統(tǒng)滅菌（如配液管道）。  

3. 過(guò)濾滅菌——針對(duì)氣體與液體  

原理：利用微孔濾膜（孔徑≤0.22 μm）截留微生物，適用于無(wú)法高溫滅菌的物料（如血清、酶溶液）或通氣系統(tǒng)。  

應(yīng)用場(chǎng)景：  

- 空氣過(guò)濾滅菌（好氧發(fā)酵核心環(huán)節(jié)）：  

 - 壓縮空氣先經(jīng)粗濾（去除塵埃顆粒）、冷卻除水，再通過(guò)0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）或尼龍濾膜，確保通入發(fā)酵罐的空氣無(wú)菌（理論過(guò)濾效率＞99.9999%）。  

- 液體培養(yǎng)基過(guò)濾：  

 - 用于熱敏性成分（如維生素C、抗生素溶液），通過(guò)深層過(guò)濾（如硅藻土過(guò)濾）結(jié)合膜過(guò)濾，例如單克隆抗體生產(chǎn)中，細(xì)胞培養(yǎng)液需經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后才能進(jìn)行純化。  

4. 輻射滅菌——特殊場(chǎng)景應(yīng)用  

原理：利用γ射線（如鈷-60）或β射線的高能粒子破壞微生物DNA，適用于一次性發(fā)酵袋（如50~200 L的Single-Use系統(tǒng)）或塑料配件。  

特點(diǎn)：  

- 無(wú)需高溫，對(duì)材料兼容性好；  

- 滅菌均勻，但需專(zhuān)業(yè)輻照裝置，成本較高，主要用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。  

三、滅菌效果驗(yàn)證與關(guān)鍵控制點(diǎn)

1. 無(wú)菌檢測(cè)：  

  - 滅菌后取發(fā)酵液樣本，接種至肉湯培養(yǎng)基，30~37℃培養(yǎng)72小時(shí)，觀察是否渾濁（雜菌生長(zhǎng)跡象）；  

  - 基因工程發(fā)酵中需增加支原體檢測(cè)（如PCR法），確保無(wú)隱性污染。  

2. 防止二次污染：  

  - 滅菌后所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行（如接種時(shí)使用火焰保護(hù)，取樣采用封閉式取樣閥）；  

  - 通氣系統(tǒng)的空氣過(guò)濾器需定期更換（通常每批次或每6個(gè)月更換，視使用頻率而定），避免濾膜堵塞或破損導(dǎo)致漏菌。  

3. 工藝優(yōu)化：  

  - 對(duì)于含固量高的培養(yǎng)基（如淀粉、黃豆餅粉），需延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高蒸汽穿透力（如增加攪拌使物料翻動(dòng)）；  

  - 采用“脈沖式滅菌”（多次短時(shí)間蒸汽沖擊）可減少熱敏感物質(zhì)損失，同時(shí)保證滅菌效果（如對(duì)含糖培養(yǎng)基，121℃滅菌20分鐘分兩次進(jìn)行，中間自然降溫至100℃以下）。  

發(fā)酵罐滅菌是純種發(fā)酵的“生命線”，其核心邏輯是根據(jù)物料特性與設(shè)備條件選擇適宜滅菌組合：  

- 蒸汽滅菌是主流，覆蓋罐體、培養(yǎng)基與管路；  

- 過(guò)濾滅菌是通氣系統(tǒng)的“剛需”，確保無(wú)菌空氣供應(yīng)；  

- 化學(xué)滅菌與輻射滅菌作為補(bǔ)充，解決高溫敏感場(chǎng)景的需求。  

通過(guò)“滅菌方法協(xié)同+過(guò)程監(jiān)控嚴(yán)格化”，可將雜菌污染概率控制在0.1%以下，保障發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性與產(chǎn)物質(zhì)量。